ỨNG
DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ TÌM VI TRÙNG LAO
(Polymerase Chain Reaction)
Ts Lâm-Kim-Cương, đại học
Rutgers New Jersey
Mycobacterium tuberculosis không thuộc nhóm Gram + hay
Gram – vì phương pháp nhuộm Gram không nhuộm được nó mặc dầu vi trùng
này cũng có 1 màng bọc peptydoglycan. Ngoài màng này còn có 1 màng sáp
làm cho các thuốc nhuộm Gram không thấm vào được. Phương pháp thường dùng
để tìm M. tuberculosis là phết đàm bệnh nhân lên kiếng (slide smear) và
nhuộm bằng Ziehl-Neelsen Stain (Acid-fast Staining Method). Thuốc nhuộm
carbon-fuchsin được đổ lên smear có vi trùng rối nung sôi để chất màu
có thể thấm vào vi trùng, sau đó rửa bằng cồn acid (acid-alcohol). Vi
trùng lao sẽ hiện ra với màu hồng rất dễ phân biệt với các vi trùng khác.
Vi trùng M. tuberculosis rất khó nuôi và sinh trưởng rất chậm. Vì vậy
muốn làm thử nghiệm để xem vi trùng nhạy cảm hay kháng thuốc thì cần phải
có một thời gian tối thiểu 3-4 tháng mới có kết quả. Dùng phương pháp
nuôi vi trùng bằng chất lỏng (liquid media) như BACTEC Systems (Becton
Dickinson, Sparks, MD,USA) thì cũng phải 3-4 tuần và cần nhiều dụng cụ
đặc biệt đắt giá.
Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu dùng PCR để định vi trùng lao (identify)
và xét định xem vi trùng sẽ kháng loại thuốc nào. Phản ứng PCR sẽ cho
kết quả nhanh chóng trong khoảng 3-4 tiếng đồng hồ.
Bộ gen (genome) của Mycobacterium tuberculosis gồm 44,411,529 base pairs
với 4000 gen trong đó có gen IS6110 được rải rác nhiều nơi trong bộ gen.
IS6110 có sequence rất cố định (very conservative). Phương pháp PCR để
tìm vi trùng Mycobacterium tuberculosis dựa trên amplification của gen
IS6110 .DNA của Mycobacterium tuberculosis được trích tinh (purification)
và dùng cho PCR với 2 dây mồi (primers). PCR sẽ amplify một đoạn DNA (fragment)
khoảng 120bp chuyên biệt cho gen IS6110. Khi PCR hoàn tất, chất thử nghiệm
(sample) sẽ dùng để điện di trên Agarose gel (agarose gel electrophoresis)
để xác định kết quả. Sự hiện diện của đoạn DNA chứng minh là có DNA của
M. tuberculosis. Nếu không thì kết quả là âm (negative).
Để tìm xem M. tuberculosis sẽ đề kháng loại thuốc nào thì chúng ta sẽ
dựa vào sequence của các gen ảnh hưởng cho loại thuốc đó để làm PCR.
1/ Đề kháng thuốc INH
(isoniazid)
Quan sát cho thấy là gen làm nhạy cảm thuốc loại INH là
katG Codon 315 (katG315). Nếu có sự biến dạng hay đột biến (mutation)
ở base thứ 2 của katG (AGC biến thành ACC hay ACA) thì vi trùng sẽ trở
thành kháng thuốc INH. Dùng DNA của M. tuberculosis và 2 giây mồi (primers)
có sequence: 5’AGCTCGTATGGCACCGGAACC3’ (20mer primer) và 5’AACGGGTCCGGGATGGTG3’
(18mer primer)(1) để làm phản ứng PCR sẽ cho ra 1 đoạn DNA dài 200bp.
Khi cắt đoạn này với restriction enzyme HapII sẽ cho ra 1 đoạn DNA dài
153bp (chứng tỏ là vi trùng nhạy cảm với INH). Nếu vi trùng trở nên đề
kháng thì mutation AGCà ACC sẽ làm cho đoạn DNA có thệm 1 gốc hapII mới
(new HapII restriction site), như vậy enzyme hapII sẽ cắt đoạn DNA thành
2 khúc nhỏ 132bp và 21bp. Khi điện giải trện agarose gel ta sẽ thấy hiện
ra 2 đoạn DNA. Như vậy là vi trùng đã kháng thuốc INH.
2/ Đề kháng thuốc rifampin:
Gen cho nhạy cảm rifampin là rpoB. Khác với kháng INH,
sự biến dạng (mutation) được thấy ở 3 nơi khác nhau trong gen rpoG (ở
codon 516, 526 và 531) khi có đề kháng thuốc Rifampin. Vì vậy trong phản
ứng PCR ta cần phải dùng ít nhất là 5 giây mồi (5 primers) mới xác định
được các biến dạng của gen rpoG.
Trở ngại khi dùng PCR
Mặc dầu phản ứng PCR rất nhanh (3-4
giờ) nhưng phản ứng này cần dùng DNA tinh khiết trích từ vi trùng Mycobacterium
tuberculosis.
Muốn trích tinh chất DNA ta phải nuôi vi trùng M.
tuberculosis cho thật nhiều mới đủ số lượng để trích tinh, như vậy cũng
phải cần 1 thời gian khá lâu trước khi thực hiện PCR.
Sau khi làm phản ứng PCR phải dùng điện di trên
Agarose để xem kết quả (3-4 tiếng đồng hồ).
Trước đây tôi đã có lần trình bày trên DDDK đề tài
“Tạo DNA mà không cần phải nuôi vi trùng”.
Ở các phòng thí nghiệm, việc nuôi vi trùng như E.
coli rất là thông thường và dễ dàng. Chỉ cần cấy vi trùng trong 1 đêm
là có thể có rất nhiều gram vi trùng để ly trích DNA. Trường hợp đặc biệt
ở đây là khi gặp phải vi trùng khó nuôi (cần phải nuôi ở nhiệt độ thật
cao, nhiệt độ thật thấp, không cần dưỡng khi anaerobic...) hoặc vi trùng
sinh trưởng rất chậm như M. tuberculosis phải cần đến 3-4 tháng, hoặc
khi ta chỉ có 1 số lượng DNA rất ít (như nước miếng, tóc, 1 giọt máu,
1 tinh trùng...) thì làm sao có thể có số lượng DNA cần thiết để làm PCR.
Một diếu tố (enzyme) mà tôi đã đưa ra công thức
để trích tinh và có hoạt tính rất mạnh được gọi là Phi29. Diếu tố này
có khả năng amplify thật nhiều DNA trong khoảng thời gian ngắn (3-4 giờ)
và ở nhiệt độ 30o C (gọi là Rolling Circle Amplification). Với 1 đơn vị
vi trùng (1 bacteria colony), Phi29 có thể amplify DNA của vi trùng lên
đến vài ug DNA để có thể làm sequencing hoặc PCR. Nếu dùng 1 ug DNA thì
trong khoảng 4 tiếng đồng hồ chúng ta có thể có đến 5 mg DNA tinh khiết
để dùng cho các thử nghiệm mà khỏi phải mất thời giờ nuôi cấy vi trùng
và ly trích DNA.
Hiện nay qPCR (quick PCR) còn gọi là RT-PCR (Real
Time PCR) được thông dụng hơn PCR vì RT-PCR dùng rất ít DNA mẫu (DNA template)
khoảng 1-10 pg cho phản ứng. Kết quả của phản ứng sẽ hiện lên trên màn
ảnh (monitor) của máy vi tính và những chi tiết dữ kiện (data) sẽ được
giữ lại ở ổ cứng (hard drive) của máy. Như vậy khi dùng RT-PCR chúng ta
sẽ có kết quả sau 3-4 giờ phản ứng mà khỏi phải dùng Agarose gel.
Ts Lâm-Kim-Cương
Ghi chú:
(1) 20mers primer là giây mồi có 20 base và 18mers primer là giây mồi
18 base. Hai giây mồi này dùng làm PCR trên gen katG.
Copyright, 2008. Muốn phổ biến bài viết này, cần xin phép tác giả và xin ghi rõ nguồn Y Dược Ngày Nay, www.yduocngaynay.com
